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聚合酶链反应产物的HPLC定量分析

作者:未知  文章来源就医网 录入时间:2006-5-22 14:47:21

 

建立了HPLC分析聚合酶链反应(PCR)产物的方法,探讨了梯度、流速、柱温等条件对相对分子质量参照物λ-DNA-HindⅢ分离的影响,NaCl以40~50mmol/min的梯度变化,流速为1mL/min时分离效果最佳。该法精密度和回收率高、线性良好,可用于PCR扩增条件优化时的相对定量分析。
关键词 高效液相色谱,聚合酶链反应

HPLC Quantitative Analysis of Polymerase Chain Reaction (PCR) Products

Liao Jie, Zhao Yulan, Dong Fangting, Yang Jun, Hao Xiuhua, Lu Zhaohui
(Medical Experiment & Analysis Center of the Chinese People’s Liberation Army General Hospital, Beijing 100853)

Abstract A method for the analysis of the polymerase chain reaction(PCR) products by HPLC was developed. The Effect of conditions, such as gradient of elution, flow rate, column temperature, etc on the separation of λ-DNA-Hind Ⅲwas examined. The separation was performed on a non _ porous ion exchange column with gradient elution of sodium chloride in 20 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 9.0) at a flow rate of 1.0 mL/min, the detection wavelength was at 260 nm. λ-DNA-Hind Ⅲdigest and β-actin PCR product were analyzed with high recovery and good linear relationship.
Keywords High performance liquid chromatography, Polymerase chain reaction

  聚合酶链反应(PCR)是一种特异性DNA序列的体外酶促合成技术,应用TaqDNA聚合酶,在1~2h内,即可使DNA的扩增达到数百万倍[1,2],目前已广泛用于基因分析、突变体构建和DNA测序等领域。PCR反应后,必须对扩增产物进行检测,目前常用的琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析速度慢、自动化程度低、定量结果误差较大,而高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快、定量准确等优点[3,4]。虽然近年来迅速发展的毛细管凝胶电泳对DNA具有更高的分辨率,已有大量用于PCR产物分析的报道[5],但HPLC在定量的准确性等方面仍具有优势。我们建立了HPLC分析PCR产物的方法,探讨了梯度、流速、柱温等各种条件对分离的影响,方法简便、快速,可用于PCR产物的相对定量分析。

1实验部分

1.1仪器、材料和主要试剂
  HP1050高效液相色谱仪,BiotechsHS-97型基因扩增仪;雄性wistar大鼠(军事医学科学院动物中心);DNA聚合酶(华美公司提供的Promaga产品);λ-DNA-HindⅢ相对分子质量参照物(华美公司);三羟甲氧基胺基甲烷(Tris)、氯化钠等国产分析纯试剂。
1.2β-actin的PCR
  本实验以大鼠中性粒细胞为样本,按常规方法提取总RNA[6],逆转录为cDNA,然后进行PCR。4°C预变性3min后,按94°C35s、72°C60s、55°C50s进行32个循环,55°C延伸5~10min。取10μL反应产物,稀释5倍,10μL注入HPLC系统。
1.3HPLC分析条件
  色谱柱:TSKgelDEAE-NPR柱(35mm×4.6mmi.d.);
  流动相:A.20mmol/LTris-HCl缓冲液,pH9.0,含0.25mol/LNaCl;B.20mmol/LTris-HCl缓冲液,pH9.0,含1.0mol/LNaCl;
  线性梯度:20%B,10min,100%B,流速1.0mL/min;
  检测波长:260nm。

2结果与讨论

2.1λ-DNA-HindⅢ相对分子质量参照物的HPLC分析
  λ-DNA-HindⅢ是λ_DNA被HindⅢ彻底水解并经加热灭活的产物,在PCR产物分析中用作相对分子质量参照物,含有以下片段:125bp、564bp、2027bp、2034bp、4361bp、6557bp、9461bp和23130bp。我们首先对其进行了分离(图1),并探讨了各种条件对分离的影响。

2.1.1氯化钠梯度对分辨率的影响用NaCl0.4mol/L至1mol/L线性梯度,流速1.0mL/min,对λ-DNA-HindⅢ进行分离,改变梯度时间,使NaCl浓度的变化速度自15mmol/min到120mmol/min,考察相邻峰分辨率的变化,结果显示(图2),9000bp以上大片段的分辨率随梯度时间(tG)的增加而增加,而较低片段的分辨率在NaCl50mmol/min变化速度以下,几乎不受tG的影响,在此速度以上,随tG的缩短而降低,对于λ-DNA-HindⅢ的分析,NaCl以40~50mmol/min的梯度变化时,分离效果最佳。

2.1.2最佳流速的选择NaCl浓度以50mmol/min的变化速度从0.4mol/L到1.0mol/L进行梯度洗脱,改变流速对λ-DNA-HindⅢ进行分离,考察流速对分辨率的影响,结果表明,最佳流速为1mL/min。
2.1.3柱温对分离的影响从25°C到60°C逐渐增加柱温,观察温度对分离的影响。在25°C到45°C之间,温度的改变对分离的影响较小,45°C以上,随温度增加,分辨率明显降低。因此我们选择在室温条件下进行分离。
2.2PCR产物的定量分析
  β-actin是横纹肌纤维和细胞细丝的蛋白质组分,常作为RT-PCR(逆转录PCR)扩增的内参照,以控制RNA提取、逆转录和PCR扩增各步骤的分析质量。用我们选定的条件对β-actinPCR产物的分离见图3。

2.2.1精密度和回收率取β-actin扩增产物,稀释5倍,每次进样10μL,测定分析的日内精密度和日间精密度(n=5),日内相对标准偏差为1.06%,日间相对标准偏差为6.11%。取β-actin扩增产物10μL进样,计算出总峰面积。取下柱子,以一根空心管连接,重复进样,计算峰面积,用两个峰面积之差,算出回收率为93.2%。
2.2.2线性关系PCR产物用流动相稀释5倍,分别进样2、5、10、15、20μL,计算进样量与峰面积的线性关系,结果显示线性良好,Y=8.85X-0.639,r=0.9997。
2.2.3PCR扩增条件的优化PCR技术的敏感性较高,很容易受各种因素的影响,要得到准确的反应结果,必须根据不同的模板,摸索最适的引物、Mg离子浓度、dNTP浓度和循环数等条件。本法具有快速、简便的特点,特别适用于寻找最佳的扩增条件。我们用所建立的方法对22到40个循环的β-actinPCR产物进行了分析,确定32为最佳循环数。

作者单位:廖杰 赵玉兰 杨军 吕朝晖 解放军总医院医学实验测试中心
     董芳霆军事医学科学院国家生物医学分析中心
     郝秀华解放军总医院基础医学研究所生化室

参考文献

1 Saiki R K, Scharf S, Falloona F, et al. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemica. Science, 1985, 230(4732): 1350
2 Saiki R K, Gelfand D H, Stofel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science, 1988, 239(4839): 487,
3 Yamakawa H, Higashion Kenich, Ohara O, et al. Sequence-dependent DNA separation by anion-exchange high-performance
liquid chromatography. Analytical Biochemistry, 1996, 240(2): 242
4 Gaus H, Lipford G B, Wagner H, et al. Quantitative analysis of lymphokine mRNA expression by a nonradioactive method using PCR and anion exchange chromatography. Journal of Immunological Methods, 1993,158(2): 229
5 Lehmann R, Voelter W, Liebich H M. Capillary Electrophoresis in Clinical Chemistry. J Chromatogr, B, 1997, 697(1): 3
6 颜光涛,辛 红,王录焕等.磷脂酶A2激活介导肠缺血再灌注后的急性肺损伤.中国危重病急救医学,1997,9(10):580 

责任编辑:un1818
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